Pemuliaan dan Regulasi Asam Glutamat (makalah yang pernah saya buat)

Pemuliaan dan Regulasi Asam Glutamat

Asam glutamat merupakan asam amino yang banyak diproduksi (4 juta ton/tahun). Glutamat sendiri adalah salah satu jenis asam amino non-essensial yang merupakan substansi dasar penyusun protein dan bisa diproduksi sendiri oleh tubuh kita untuk keperluan metabolisme serta ditemukan hampir di dalam setiap makanan yang mengandung protein. Beberapa jenis makanan yang mengandung glutamat dari alam adalah tomat, keju, saos soja, saos ikan, dan bahkan juga terdapat di air susu ibu (ASI). Asam glutamat biasanya digunakan pada produksi MSG.

MSG pertama kali dipatenkan oleh perusahan yang berkedudukan di Jepang, Ajinomoto. Dengan pasokannya yang sekitar 30% dari seluruh MSG di dunia, Ajinomoto telah mendominasi pasar sejak ditemukannya bahan aditif sintesis ini.

Dalam bentuk aslinya MSG berupa serbuk putih yang mengkristal dan jika dilarutkan dalam air, akan terurai menjadi ion Sodium (dikenal juga dengan nama Natrium) serta ion Glutamat. MSG menjadi semakin favorit karna tidak berwarna, berbentuk kristal, dan mudah dalam penggunaan serta dalam penyimpanannya. Satu-satunya yang dipengaruhi oleh MSG adalah rasa dalam makanan tersebut. MSG tidak membuat kualitas makanan jelek menjadi lebih baik atau tidak membuat makanan menjadi lebih awet, tapi MSG membuat makanan menjadi lebih enak.

Pada Abad 21 teknik pembuatan MSG mulai beragam. Menurut "The Encyclopedia of Common Natural Ingredients" MSG bisa diproduksi dengan menggunakan proses klasik (proses ekstraksi), teknik hidrolisis protein, sintesis kimia, dan fermentasi oleh mikroba. Dalam makalah ini hanya teknik fermentasi yang akan dibahas lebih lanjut.

Fermentasi

Medium yang digunakan dapat berupa bahan mentah terutama yang mengandung karbon (C): glukosa, fruktosa, maltosa, sukrosa, xilosa, dan asam asetat serta sumber nitrogen (N): garam ammonium, ammonia (NH3). Selain sumber C dan N juga diperlukan biotin dalam medium yang merupakan faktor pembatas, tergantung sumber C yang digunakan. Contoh medium yang sering digunakan adalah molase atau tetes tebu.

Mikroba yang dapat melakukan fermentasi asam glutamate adalah bakteri gram positif nonmotile yang membutuhkan biotin untuk tumbuh dalam jumlah sedikit atau aktivitas α-ketoglutarate dehydrogenase dan aktivitas glutamate dehydrogenase yang tinggi seperti Micrococcus glutamicus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter.

Perubahan permeabilitas dapat meningkatkan produksi asam glutamat oleh Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, dan Microbacterium. Kunci dari over produksi glutamat adalah karena spesies tersebut tidak mempunyai enzim α-ketoglutarat dehidrogenase yang memecah α-ketoglutarat menjadi suksinil-CoA, dan membutuhkan biotin (tidak dapat mensintesis biotin).

Jika ditumbuhkan pada glukosa, spesies ini dapat memproduksi glutamat, terkumpul di dalam sel sampai 50 mg/g berat kering, dan karena adanya regulasi umpan balik, produksi glutamat dapat berhenti. Jika permeabilitas sel dinaikkan, glutamat menjadi lebih mudah dikeluarkan dari sel, mengakibatkan konsentrasi glutamat di dalam sel tetap rendah, dan produksi glutamat terus berlangsung.
Perubahan permeabilitas dapat dilakukan dengan cara:

1. Penggunaan biotin yang terbatas ( konsentrasi sangat rendah, biasanya 9-5 mg/L

2. Penambahan Penicillin atau turunan asam lemak.
Konsentrasi biotin yang rendah dan penambahan Penicillin atau turunan asam lemak akan menurunkan konsentrasi fosfolipid di dalam membran sehingga permeabilitas membran berubah.

Fermentasi berlangsung dalam kondisi yang aerobik sehingga membutuhkan sistem aerasi. Reaksi yang terjadi selama fermentasi adalah sebagai berikut:

C6H12O6 + NH3 + 1,5 O2 C4H9O4N + CO2 + 3 H2O
(glukosa) (asam glutamat)

3 C2H4O2 + NH3 + 1,5 O2 C4H9O4N + CO2 + 3 H2O
(asetat) (asam glutamat)

Lintasan atau jalur biosintesa asam glutamat perlu dipelajari untuk pengenalan sifat-sifat mikroba dan kondisi fermentasi optimum sehingga yield yang diperoleh lebih banyak.

Pembentukan asam glutamat dari glukosa membutuhkan sekurang-kurangnya 16 tahap reaksi enzimatis. Asam alpha-ketoglutarat diubah menjadi asam glutamat melalui reaksi reduktif aminasi (penambahan NH3). Enzim yang mengkatalisa reaksi tersebut adalah NADP-specific glutamic acid dehidrogenase. Untuk mengaktifkan enzim tersebut diperlukan NADPH2.

Untuk mengubah glukosa menjadi senyawa dengan tiga atom dan dua atom karbon, disamping menggunakan jalur HMP (hexomonophosphat) juga menggunakan jalur EMP (embden meyerhoff-parnas). Lintasan HMP menghasilkan lebih banyak NADPH2 yang diperlukan untuk reaksi konversi asam α-ketoglutarat menjadi asam glutamat.

Fermentasi asam glutamat merupakan fermentasi aerobik, maka kekurangan oksigen selama proses fermentasi menyebabkan jalur EMP lebih dominan. Hasilnya adalah banyak dihasilkannya asam-asam organik lain, seperti asam laktat, akibatnya asam glutamat yang terakumulasi berkurang.

Fermentasi berlangsung selama 35-45 jam kemudian hasil fermentasi tersebut disentrifus untuk menghilangkan biomassa yang terbentuk dan bahan-bahan padat organik lainnya. Asam glutamat yang ada dalam larutan induk dipisahkan dengan resin, di mana asam glutamat akan tertahan di dalam resin.

Untuk mendapatkan MSG, resin yang sudah mengandung asam glutamat diregenerasi dengan larutan NaOH, dimana larutan yang telah digunakan untuk meregenerasi resin sudah mengandung MSG, selanjutnya untuk mendapatkan MSG yang putih, larutan ini didekolorisasi dengan karbon aktif. Pembentukan MSG secara kimia dapat dilihat dari reakasi berikut:

C5H9NO4 + NaOH C5H8NO4Na + H2O
(asam glutamat) (monosodium glutamat)

Larutan induk yang sudah didekolorisasi mengandung MSG dalam konsentrasi yang rendah, untuk menaikkan konsentrasi MSG dalam larutan, maka perlu dievaporasi, untuk mendapatkan kristal MSG dilakukan dengan penurunan suhu larutan induk dengan proses kristalisasi.

Regulasi
Mikroorganisme yang mampu menghasilkan asam glutamat langsung dari glukosa banyak tersebar di alam. Walaupun kapang, khamir dan Actinomyces dinyatakan mampu menghasilkan asam glutamat tapi hanya bakteri yang diketahui mampu menghasilkan asam glutamat lebih dari 40 persen dari glukosa, dengan konsentrasi glukosa dalam media lebih dari 10 persen.
Laboratorium perusahaan penghasil MSG (Monosodium glutamat) mengisolasi dan meneliti strain-strain bakteri penghasil asam glutamat dari lingkungan alam maupun mutannya. Skema teknik isolasi dan seleksi mikroorganisme penghasil asam glutamat dari tanah dapat dilihat pada bagan berikut ini.

Tanah

Air murni steril

Pembiakan di cawan
petri
Media:
Agar 15 g/l
Glukosa 10 g/l
Polipepton 5 g/l
Yeast extract 2.5 g/l
NaCl 1.2 g/l
pH diatur 7 dengan NaOH
Suhu inkubasi 300 C
Isolasi monokloni
Media : seperti di atas
Fermentasi di dalam
labu Kolben

Media:
Glukosa 25 g/l
KH2PO4 1 g/l
Mameno 0.3 g/l
Urea 2.5 g/l
MgSO4 0.4 g/l
FeSO4 0.01 g/l
MnSO4 200 g/l
Antifoam 0.02 g/l
pH diatur 7 dengan larutan NaOH
Suhu inkubasi 300 C
Uji Kromatografi
Lapis Tipis

Contoh tanah diambil kemudian dilarutkan dalam air murni steril, dikocok, dan disaring. Sejumlah filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam cawan petri berisi media agar dengan teknik tuang maupun teknik penyapuan (spreading). Dalam hal ini teknik penyapuan mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan teknik tuang. Pertama, karena pada umumnya bakteri penghasil asam amino adalah aerobik maka teknik penyapuan pada permukaan memperbesar peluang tumbuhnya bakteri aerobik. Kedua, pada teknik penyapuan, bakteri tumbuh pada permukaan media sehingga memudahkan isolasi koloni.

Cawan petri diinkubasi pada suhu 300 C selama 20 jam. Kemudian dilakukan isolasi monokloni terhadap koloni bakteri yang sifat koloninya diduga merupakan bakteri penghasil asam glutamat. Koloni Brevibacterium flavum yang ditumbuhkan dari kultur murni dijadikan sebagai pembanding. Bentuk koloni dari Brevibacterium flavum adalah bulat, berwarna kuning, tidak berlendir, tepi koloni rata, elevasi cembung, dan tidak ada tanda-tanda spesifik lainnya. Koloni yang tumbuh dalam cawan petri yang mempunyai karakteristik seperti tersebut di atas kemudian diisolasikan dan dipindahkan ke media agar miring.

Teknik penggoresan yang dilakukan pada media agar miring adalah zig-zag. Dengan teknik ini diharapkan bakteri tumbuh dengan cepat dan banyak. Selanjutnya agar miring diinkubasi pada suhu 310 C selama 24 jam.

Bakteri yang tumbuh pada masing-masing agar miring kemudian dicoba digunakan pada fermentasi dalam labu Kolben, tujuannya yaitu untuk melihat kemungkinan bakteri tersebut menghasilkan asam glutamat.

Pengujian secara kualitatif terhadap adanya asam glutamat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (thin layer chromatography). Laju spesifik (Rf) spot dari sampel hasil fermentasi di dalam labu Kolben dibandingkan dengan spot asam glutamat standar.

Bila ditemukan bakteri penghasil asam glutamat maka kemudian dilakukan percobaan-percobaan dengan berbagai perlakuan untuk mendapatkan hasil yang optimal. Sebagai contoh ialah percobaan teknik mutasi dan percobaan variasi media sehingga dihasilkan strain serta kondisi fermentasi yang optimal menghasilkan asam glutamat.
Sintesis asam amino menggunakan dua galur mikroba, yaitu stringent strain dan relaxed strain. Stringent strain adalah mikroba yangn berhenti membentuk asam amino apabila jumlah asam amino yang diproduksi sudah mencukupi kebutuhannya. Mikroba ini bersifat menghemat sumber-sumber makanan yang jumlahnya terbatas di alam. Sintesa asam amino dihambat karena terbentuknya senyawa Guanosin Tetra Phosphat dan Guanosin Penta Phosphat. Relaxed strain tidak membentuk kedua zat tersebut, sehingga dapat mensintesa asam amino dalam jumlah yang melebihi kebutuhannya.

Mikroba penghasil asam glutamat termasuk dalam relaxed strain. Hal ini disebabkan karena mikroba tersebut kekurangan enzim alpha–ketoglutarat dehidrogenase yang diperlukan untuk mengubah asam alpha-ketoglutarat menjadi suksinil-CoA dalm siklus Kreb. Dengan adanya NH3 yang diberikan selama fermentasi, asaam alpha-ketoglutarat diubah menjadi asam glutarat.

Fermentasi asam glutamat dapat dibedakan menjadi dua grup berdasarkan kelompok mikroba yang digunakan, yaitu fermentasi galur liar dan fermentasi galur mutan.

1. Galur Liar
Galur liar yang dapat memproduksi asam glutamat adalah Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium dan Microbacterium. Kebanyakan bakteri pembentuk asam glutamat adalah gram positif, non motil, tidak membentuk spora, dan yang terpenting adalah bakteri-bakteri tersebut semuanya membutuhkan biotin untuk pertumbuhannya, serta kekurangan enzim α-ketoglutarat dehidrogenase.Telah diketahui bahwa biotin mempunyai peranan dalam ekskresi asam glutamat. Asam glutamat banyak terakumulasi dalam media kultur bila konsentrasi biotin berada di bawah kondisi optimum yang diperlukan untuk pertumbuhan sel bakteri. Pemberian lebih banyak biotin akan meningkatkan pertumbuhan sel tetapi menurunkan akumulasi asam glutamat. Konsentrasi kritis biotin untuk ekskresi asam glutamat adalah 0.5 mikrogram per liter media.

Kekurangan biotin tidak berarti menyebabkan berkurangnya aktifitas sintesa asam glutamat, tetapi berkurangnya permeabilitas mebran sel. Kekurangan biotin menyebabkan perubahan komposisi membran sel yaitu menurunkan kandungan fosfolipid dan meningkatkan rasio molar dari asam lemak jenuh dan asama lemak tak jenuh menjadi lebih besar dari satu. Dalm hal ini biotin berperanan dalam sintesa asam lemak di dalam sel.

Biotin diperlukan dalam sintesa asam-asam lemak. Biotin dan ATP diperlukan oleh enzim asetil-CoA karboksilase dalam mengubah asetil-CoA menjadi malonil-CoA yang seterusnya menjadi asam-asam lemak. Peranan biotin dapat digantikan oleh asam oleat. Mutan yang memerlukan asam oleat dapat mengakumulasi asam glutamat bila ditumbuhkan pada media dengan kandungan asam oleat terbatas, walaupun kelebihan biotin.

Penambahan turunan asam lemak yaitu POEFE ( poly oxyethilene fatty acid ester) mempunyai efek yang sama dengan biotin dalam ekskresi asam glutamat, yaitu menyebabkan perubahan komposisi membran sel.

Penisilin juga menyebabkan ekskresi asam glutamat, namun dalam hal ini efek penisilin berbeda dengan biotin atau POEFE. Penisilin menghambat sintesa membran sel, sehingga membran sel tipis dan dapat mengekskresikan asam glutamat. Hal ini diikuti dengan perubahan bentuk sel menjadi lebih panjang atau lebih cembung.

Kerja POEFE tidak tergantung pada tekanan osmotik media, sedangkan penisilin hanya dapat mengekskresikan asam glutamat bila tekanan osmotik cukup rendah, sehingga penisilin tidak efektif digunakan dalam media dengan tekanan osmotik tinggi.

Penambahan asam lemak jenuh C16-18 menghambat sintesa asam oleat dengan cara menahan enzim asetil-CoA karboksilase. Penurunan asam oleat menghambat pembentukan fosfolipid, sehingga terjadi kebocoran sel.

Fermentasi dengan menggunakan galur liar memproduksi asam glutamat dalam jumlah sedikit, karena tergantung pada mekanisme pengaturan dalam jalur biosintesa. Galur liar Collobacterium coliform mengakumulasi 15 gram asam glutamat per liter media.


2. Galur Liar
Mutasi terhadap galur liar dimaksudkan untuk memperoleh galur yang memproduksi asam glutamat dalam jumlah yang tinggi, mempunyai toleransi besar terhadap perubahan kondisi, mempunyai kisaran pH dan suhu yang lebar serta tahan terhadap kadar gula tinggi.

Dua cara yang biasa digunakan untuk pengaturan biosintesa asam amino ialah feed back inhibition dan feed back repression. Mekanisme FBI dapat dijelaskan denagan teori protein alosterik dimana hasil metabolit akhir dari jalur biosintesa menghambat enzim sebelumnya. Enzim yang dihambat ini adalah protein alosterik yang mempunyai sisi aktif dan sisi regulatori pada permukaannya. Sisi regulatori dapat bereaksi dengan inhibitor dan menyebabkan perubahan bentuk (pengkerutan) protein alosterik serta mempengaruhi sisi aktif. Hal ini menyebabkan sisi aktif tidak dapat bereaksi dengan substrat dan enzim tidak aktif lagi. Dengan demikian, inhibisi menghambat kerja enzim.

Berbeda dengan inhibisi, represi menghambat pembentukan enzim. Dalam proses ini produk akhir mengontrol jumlah enzim dalam jalur biosintesa. Ada empat gen yang berperan dalam sintesa protein, yaitu RPOS (operon) yang terdiri dari R(gen represor), P (gen promotor), O (gen operator), dan S (gen struktural). Pembentukan enzim secara normal terjadi bila tidak ada korepresor yang bergabung dengan aporepresor dan menghalangi proses transkripsi. Korepresor biasanya produk akhir atau turunannya. Jika represor aktif menyerang pada gen O pada DNA, transkripsi atau transfer kode-kode genetik dari gen S kepada mRNA tidak terjadi.

Untuk memproduksi beberapa asam amino intermediat pada biosintesa asam amino, termasuk asam glutamat, dapat digunakan auksotrop dimana jalur biosintesa telah dihalangi, yaitu dengan membunuh mikroba pada media yang mengandung sedikit asam amino represor. Dengan demikian, mikroba masih tetap hidup dan terbebas dari FBI dan FBR. Mutan tersebut dikenal sebagi mutan auksotrop. Dalam fermentasi asam glutamat dikenal Brevibacterium thiogenitalis yang merupakan mutan auksotrop asam oleat dan Corynebacterium alcanolyticum, suatu mutan auksotrop gliserol.